STR鑒定技術(shù)靈敏度堪憂？普遍還是個例？

發(fā)布時間:2024/12/25分類:技術(shù)文章來源:科佰生物

背景

STR（Short Tandem Repeat，短串聯(lián)重復(fù)序列）是指DNA序列中存在的一種特殊模式，即一串較短的核苷酸序列重復(fù)排列。

在個體身份鑒定方面，STR檢測被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如刑事偵查，失蹤人口鑒定，災(zāi)難遺體識別等。同時，STR檢測也是目前親子鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)方法，其準(zhǔn)確性和可靠性得到了廣泛的認(rèn)可。

在細(xì)胞鑒定方面，2011年美國國家標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會發(fā)布了一份專門的細(xì)胞STR鑒定標(biāo)準(zhǔn)，ChP（中華人民共和國藥典）也規(guī)定了細(xì)胞系質(zhì)量控制的STR試驗。STR基因分型已被ICLAC、ATCC等權(quán)威機構(gòu)作為金標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于細(xì)胞鑒定。

Fig 1. STR檢測技術(shù)的原理。

近年來，法醫(yī)物證鑒定中遇到了許多新挑戰(zhàn)，尤其是在提取和檢測混雜樣本（如含少量嫌疑人DNA的死者樣本）時，現(xiàn)有的毛細(xì)血管電泳結(jié)合PCR技術(shù)（Capillary Electrophoresis PCR, CE-PCR）在靈敏度上的局限性逐漸顯現(xiàn)，難以應(yīng)對復(fù)雜、微量DNA樣本的鑒定需求。同時在科研細(xì)胞培養(yǎng)過程中，如果存在輕微的細(xì)胞交叉污染，現(xiàn)有的STR檢測技術(shù)也無法準(zhǔn)確檢測出。因此，我們亟需尋找更高靈敏度、更先進(jìn)的分子檢測技術(shù)，以提升鑒定效果和可靠性。

實驗設(shè)計

為了更全面了解市場上CE方法在鑒定細(xì)胞污染時的檢測限，科佰生物設(shè)計了一項實驗：對比不同公司檢測服務(wù)的靈敏度和準(zhǔn)確性?？瓢凵锸褂胐dPCR技術(shù)（數(shù)字PCR法）準(zhǔn)確制備了不同比例的細(xì)胞污染混合gDNA樣本：10%污染樣本，20%污染樣本和30%污染樣本，將上述樣本分別送至三家檢測公司（標(biāo)記為A、B、C），并采用其CE方法進(jìn)行檢測，對比各公司檢測結(jié)果的靈敏度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，評估其在不同污染比例樣本中的表現(xiàn)。

實驗結(jié)論

三家公司均未檢測出10%的污染樣本，有兩家檢測出20%污染樣本和30%污染樣本，但是分析未報出全部差異位點，一家三個污染樣本均未檢出。通過分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了與CE的靈敏度相關(guān)外，與實驗人員對結(jié)果的判讀也有很大關(guān)系。

Fig 2. 不同污染占比濃度的STR樣本在三家公司Penta E基因座的STR檢測結(jié)果圖，其他20個基因座有類似的情況，文中不一一羅列。

實驗分析

1. 現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)

傳統(tǒng)STR技術(shù)的局限性：STR（短串聯(lián)重復(fù)序列）作為法醫(yī)DNA鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在檢測混合樣本及微量DNA樣本時，其靈敏度受到限制。尤其對于死者樣本中含有少量嫌疑人DNA的情況，毛細(xì)血管電泳技術(shù)可能無法有效檢出。

受到MSI（微衛(wèi)星不穩(wěn)定性）檢測的啟示：MSI伴隨診斷試劑盒，檢測限可達(dá)30%。雖然MSI主要針對單核苷酸和二核苷酸重復(fù)序列，技術(shù)難度較高，但也提示我們，四核苷酸重復(fù)序列的STR可能具備更高的靈敏度開發(fā)潛力。

新興技術(shù)的可能性：NGS（下一代測序）和dPCR（數(shù)字PCR）技術(shù)作為更為精準(zhǔn)和靈敏的分子檢測工具，已在臨床、科研等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。將這些技術(shù)應(yīng)用于STR檢測中，或許可以突破現(xiàn)有STR檢測的靈敏度瓶頸。

2. NGS與dPCR在STR檢測中的優(yōu)勢

NGS技術(shù)：

高靈敏度與多位點檢測：NGS可實現(xiàn)對多個STR位點的深度測序，提高檢測靈敏度，尤其適用于復(fù)雜混合樣本的分析。
SNP與STR結(jié)合：已有公司推出基于SNP的NGS方法，這為STR檢測提供了新的思路。將NGS技術(shù)與STR檢測相結(jié)合，可提高樣本分辨率與靈敏度。
溯源與個體識別：NGS可以實現(xiàn)對微量DNA樣本的高通量檢測，區(qū)分相近細(xì)胞系，同時還可以檢測細(xì)微的污染，同時針對鼠源以及人源，不需要做二次實驗。

DdPCR技術(shù)：

超高靈敏度：dPCR通過將DNA樣本進(jìn)行絕對定量分割，可實現(xiàn)對極微量DNA的精準(zhǔn)定量，檢測靈敏度遠(yuǎn)超傳統(tǒng)PCR技術(shù)。
絕對定量與低豐度檢測：dPCR在低豐度DNA檢測方面優(yōu)勢顯著，特別適用于微量DNA或高混合度樣本的分析。
STR位點檢測的潛力：將dPCR技術(shù)應(yīng)用于STR檢測，可進(jìn)一步提升微量DNA的檢出能力，彌補傳統(tǒng)PCR的不足。

3.倡議與發(fā)展方向：

面對快速變化的科學(xué)需求和技術(shù)挑戰(zhàn)，STR技術(shù)的進(jìn)一步升級迫在眉睫。為推動STR技術(shù)創(chuàng)新與優(yōu)化，滿足更高精度、更廣泛應(yīng)用的需求，我們特此發(fā)出倡議：

研發(fā)更高靈敏度的NGS-STR方法：結(jié)合NGS的高通量與精準(zhǔn)性，開發(fā)針對STR位點的高靈敏度測序方法，用于混合樣本鑒定。
探索dPCR在STR檢測中的應(yīng)用：優(yōu)化數(shù)字PCR技術(shù)，使其能夠精準(zhǔn)檢測微量、低豐度的STR位點，尤其是復(fù)雜背景下的樣本。
多技術(shù)融合：整合NGS、dPCR與SNP分析，形成靈敏度更高、分辨率更強的法醫(yī)物證鑒定體系。
其他方法學(xué)。