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突變頻率AF的稀釋：野生型不含突變的細(xì)胞系核酸與含有特定突變的細(xì)胞系核酸進(jìn)行混合，對(duì)于AF突變頻率的稀釋通常不能簡(jiǎn)單考慮野生型核酸及突變核酸的質(zhì)量比，而需要突變基因位點(diǎn)的原始頻率，突變及野生型基因核酸所含的目的基因拷貝數(shù)，野生及突變型核酸樣本的基因組整體分子量（染色體倍性）等多個(gè)維度進(jìn)行考慮，科佰生物開發(fā)了一套獨(dú)特的算法，將上述因素均納入該計(jì)算方法中，使得計(jì)算的理論突變及野生型核酸混合比例最大程度的精確，同時(shí)對(duì)稀釋后的樣品進(jìn)行數(shù)字PCR絕對(duì)定量，再根據(jù)定量的結(jié)果對(duì)與理論AF%值有一定偏差的結(jié)果進(jìn)行微調(diào)以后再次數(shù)字PCR定量，使得稀釋樣品的AF%處于使用預(yù)期的合理范圍內(nèi)濃度的稀釋：一般gDNA濃度在40ng/ul，如果需要低濃度，那么使用對(duì)應(yīng)的緩沖液對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行稀釋。

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科佰的突變頻率AF是通過(guò)數(shù)字PCR檢測(cè)的，誤差范圍如下：

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AF檢測(cè)結(jié)果不符合預(yù)期的原因可能是多方面，通常有以下幾個(gè)常見的原因，1）技術(shù)平臺(tái)方法學(xué)的差異，COA呈現(xiàn)的AF值及誤差范圍是基于數(shù)字PCR絕對(duì)定量計(jì)算的結(jié)果，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品用其它方法學(xué)檢測(cè)時(shí)(例如NGS),這種AF的偏差可能被放大，這種放大又和檢測(cè)突變的類型，目的基因的拷貝數(shù)及序列的特殊性，樣本的染色體倍性，具體采用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線，以及后期的生信分析方法相關(guān)，具體來(lái)說(shuō)1）當(dāng)突變?yōu)镾NV時(shí)一般數(shù)字PCR與NGS獲得的AF值偏差較小，而CNV及融合突變的AF值偏差較大，從實(shí)驗(yàn)的角度數(shù)字PCR是完整的gDNA樣品進(jìn)行一個(gè)擴(kuò)增定量，而NGS建庫(kù)過(guò)程中往往需要對(duì)樣品進(jìn)行打斷，打斷通常容易使CNV及融合突變的AF與打斷前發(fā)生一定的偏差，我們用數(shù)字PCR對(duì)打斷前后的CNV及融合突變樣品檢測(cè)往往也會(huì)觀察到這個(gè)現(xiàn)象，這種打斷以后產(chǎn)生的差異我們?cè)谝恍┱w染色體倍性異常的樣品上也有所發(fā)現(xiàn), 另外從檢測(cè)后的生信分析角度來(lái)看，SNV AF值的計(jì)算分析方法相對(duì)成熟統(tǒng)一，也更接近于數(shù)字PCR AF值的計(jì)算原理，所以NGS和數(shù)字PCR結(jié)果之間往往差異較小，而CNV和融合突變的AF計(jì)算更依賴于生信算法，方案不太統(tǒng)一成熟，各家算法差異較大，這也是導(dǎo)致其與數(shù)字PCR定標(biāo)AF存在較大差異的原因之一。此外，從方法學(xué)角度，數(shù)字PCR只是簡(jiǎn)單的一次PCR的絕對(duì)定量方法，而NGS方法無(wú)論是擴(kuò)增子還是捕獲方案，建庫(kù)及測(cè)序過(guò)程中可能都涉及多次或多重PCR，PCR的過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一些偏向性擴(kuò)增，導(dǎo)致AF值發(fā)生一定偏離，我們也曾通過(guò)一些數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)某些樣本和位點(diǎn)建庫(kù)前和建庫(kù)后的PCR產(chǎn)物AF值存在差異；另外，某些NGS測(cè)序深度不足或者不均一也會(huì)導(dǎo)致AF值與預(yù)期不符，例如某些GC含量過(guò)高或過(guò)低的區(qū)域位點(diǎn)，可能會(huì)存在深度與其它區(qū)域比不均一的情況，導(dǎo)致AF偏離， 另外對(duì)于某些拷貝數(shù)擴(kuò)增，且擴(kuò)增數(shù)比較高的位點(diǎn)，會(huì)存在局部測(cè)序深度不夠，導(dǎo)致檢測(cè)上限低于真實(shí)拷貝數(shù)，需要更高的測(cè)序深度才能反映真實(shí)的拷貝數(shù)。

以上只是一些常見的AF值偏離的原因，總而言之，AF值不符的原因是多方面且復(fù)雜的，具體案例還需要具體分析，當(dāng)遇到實(shí)際案例時(shí)可能我們需要客戶的一些原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)才能便于我們分析原因。

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科佰生物的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源的細(xì)胞系是含有一些內(nèi)源性突變的，這些突變的全外顯子測(cè)序結(jié)果可以在購(gòu)買后咨詢我們的銷售人員獲取。

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160bp±10%的DNA片段，模擬液體活檢病人樣本；由①gDNA超聲打斷或②酶切處理染色體后提取獲得；可提供純化后的ctDNA片段，也可以將ctDNA 按一定的濃度溶入人工血漿中模擬臨床上未純化的血漿樣本，我們一般不對(duì)產(chǎn)品提供末端修復(fù)，客戶可根據(jù)自己的應(yīng)用場(chǎng)景需要自行進(jìn)行修復(fù)。

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FFPE標(biāo)準(zhǔn)品是將一定數(shù)量的特定突變細(xì)胞福爾馬林固定，包埋形成石蠟塊形式；石蠟塊切片制作為石蠟切片形式。

試劑盒：

QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen)

Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) 

規(guī)格提取量：>400 ng per two slides with 15 μm/slide

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參考 從《指導(dǎo)原則》中分析參考品盤設(shè)計(jì)

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1）數(shù)字PCR的引物探針針對(duì)SNV，或者較短的Indel (如EGFR 19Del, 20Ins等)，通常包含一對(duì)引物，以及兩條分別標(biāo)記不同熒光基團(tuán)（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探針用于識(shí)別突變及野生型拷貝數(shù)。

2）數(shù)字PCR的引物探針針對(duì)CNV,通常包含兩對(duì)不同的引物及兩條標(biāo)記不同熒光基團(tuán)（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探針，用于分別擴(kuò)增識(shí)別定量目的基因及內(nèi)參基因的拷貝數(shù)。（內(nèi)參基因一般選擇較為保守不易發(fā)生拷貝數(shù)變異的基因，例如RPP30，盡管內(nèi)參基因拷貝數(shù)相對(duì)保守，不易發(fā)生拷貝數(shù)異常，但這不是絕對(duì)的，有時(shí)為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，可以考慮選擇兩到三個(gè)不同的內(nèi)參基因來(lái)比較，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性）。

3）數(shù)字PCR的引物探針針對(duì)DNA融合突變，通常包含兩對(duì)不同的引物及兩條標(biāo)記不同熒光基團(tuán)（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探針，用于分別擴(kuò)增識(shí)別定量目的基因突變BREAKPOINT拷貝數(shù)及總的目的基因拷貝數(shù)。

4）數(shù)字PCR的引物探針針對(duì)RNA，通常包一對(duì)引物及一條標(biāo)記熒光基團(tuán)的探針，用于擴(kuò)增識(shí)別定量目的基因拷貝數(shù)。